1
概述
生物人工肝(
bioartificial liver)的本义是指通过组织工程技术制造的可供移植的肝脏,由于现有技术尚不能实现人造肝脏,目前所说的生物人工肝专指以培养肝细胞为基础的体外生物人工肝支持系统或装置。
生物人工肝由“肝细胞、生物反应器、辅助装置”三部分组成,关键材料是培养的具有正常活性与功能的肝细胞,核心是可供细胞培养(或放置)并能与治疗对象血循环相接的生物反应器。具体原理是将培养的肝细胞置于特殊的生物反应器内,利用体外循环装置将肝衰竭患者血液
/血浆引入反应器,通过反应器内的半透膜(或直接与肝细胞接触)进行物质交换与生物作用。由于这一过程如同正常机体血液流过肝窦一样,一方面血液中的毒性物质被培养肝细胞摄取、转化、代谢;另一方面血液中因肝衰竭而缺乏的机体必需物质由培养肝细胞合成、补充,从而实现理想模式的人工肝支持与治疗。
生物人工肝研究的兴起得益于上世纪
80年代肝细胞分离、培养技术的成熟,研究于
2000年前后达高峰,
2004年
美国
HepatAssist 2000型人工肝完成多中心随机临床研究后渐渐转入低谷。目前生物人工肝临床研究
受困的原因,一是细胞来源受限,二是生物反应器设计欠佳,三是
临床疗效未达到预期。这即与肝脏本身的组成与功能十分复杂有关,又与
目前人们对肝衰竭发病机制认识的不足有关。但可以肯定的是,与非生物人工肝(物理型和中间型)相比,以肝细胞为材料的生物人工肝最能模拟和替代肝脏的功能,因此,其依然是肝衰竭治疗的希望
。
2
研究进展
2.1
细胞材料
生物人工肝研究至今,人肝细胞、猪肝细胞和肿瘤来源的肝细胞系都曾被应用于临床研究,分别因来源缺乏、可能传播动物源性传染病和远期致瘤危险而受限。近年来干细胞的研究为解决生物人工肝的细胞来源带来了新的希望。从理论上讲,干细胞诱导分化成肝细胞将有可能为生物人工肝提供新的细胞源。
相关研究已有报道,如
Soto-Gutié
rrez等采用鼠
ESc与几种人肝非实质细胞系共培养,辅以细胞生长等对
ESc进行肝细胞分化,在证实分化细胞能表达肝细胞标志物并具有分泌白蛋白,代谢氨、安定、利多卡因等功能后,将含有分化细胞的生物反应器植入
90%肝切除鼠体内,结果不仅改善了模型动物的肝功能,而且延长了存活时间。
Parekkadan等将
BMSCs用于生物人工肝的动物实验研究,结果显示培养有
MSC的生物反应器和
MSC条件培养液(培养上清)能显著减少肝衰竭动物肝组织的白细胞浸润、肝细胞死亡和胆小管增生,并显著提高肝衰竭动物的存活率。这些研究均提示干细胞可以成为生物人工肝理想的细胞源。
生物人工肝
肝细胞培养的原则是大量、
高密度、高活性培养,并尽可能地
长时间培养。因为要保持完整的肝脏功能,成人至少要
150~
450g肝细胞
[临床上患者肝脏功能并未丧失殆尽,肝细胞可少至(
3~
5)×
109],
传统的单层培养方法难以达到
细胞量的要求,也难以维持细胞的活性与功能,三维培养是
解决这一问题的最佳方式。为此,已出现了多种细胞培养方法,如在
新分离的肝细胞悬液中,加入经胶原被覆的葡聚糖微载体间隙振动,可使肝细胞粘附于微载体进行高密度培养;根据肝细胞有相互聚集的特性,在肝细胞分离后,采用抑制肝细胞单层贴壁生长方法,可促进其相互聚集成多细胞球形体;将肝细胞直接置于生物反应器培养,如中空纤维培养细胞法、胶原凝胶制动等也可实现肝细胞的高密度、长期高活性培养。近来,在生物反应器内进行肝细胞的组织工程化培养愈来愈引起重视。
2.2
生物反应器
反应器是生物人工肝的心脏。理想的生物反应器应为肝细胞提供良好的生存条件,并进行高效的物质交换。目前的生物反应器大致分为中空纤维生物反应器、平板单层生物反应器、灌注床或支架生物反应器和包被悬浮生物反应器
4类。单层平板式生物反应器因存在死腔、“放大”困难已趋于淘汰。中空纤维式反应器即可用于培养,又可直接用于生物人工肝治疗,且在免疫阻隔和物质传输上具有明显优势,因而被广泛应用。但该反应器的中空纤维膜材料大多数为借用血液净化的半透膜材料,肝细胞相容性较差,细胞分布不均、缺氧、交换效率低。近年来,研究者利用半乳糖化改良聚二氟乙烯中空纤维和采用磷脂聚合物修改纤维素中空纤维均有效地提高了肝细胞的培养效果,表明通过制备生物人工肝反应器专用的半透膜材料可进一步改善中空纤维型生物反应器的功能。
灌注床
/支架生物反应器和包被悬浮生物反应器尚处于研究阶段,其最大的优点是肝细胞培养状态良好,缺点是免疫阻隔欠缺。针对这种情况,我们新近完成了一种杂交型三维立体式生物反应器的构建,该反应器由液体阻力小、通量大、物质传输效率高的单皮层多孔中空纤维与三维支架材料骨架杂交而成,集合了中空纤维生物反应器与灌注床、支架型生物反应器的优点,已系统评价了该反应器的物质传输、肝细胞培养、细胞功能以及对重型肝炎病人血浆的影响等,正在进行人工肝支持实验。
2.3
体外装置
/系统及临床
研究
自
1987年肝细胞型生物人工肝首次治疗暴发性肝衰竭获得成功以来,不同类型的生物人工肝先后进入到临床
Ⅰ
~
Ⅲ
期研究阶段,这些生物人工肝装置
/系统有美国的
HepatAssist、
ELAD(
extracorporeal liver assist device)、
BLSS(
Bioartificial liver support system)、德国的
MELS (Modular extracorporeal liver support)、荷兰的
AMC-BAL (Amsterdam Medical Centre-BAL)。其装置
/系统特征及主要临床研究结果见下表。
Synopsis of clinical studies of cell-based bioartificial liver support.
|
Technology/ Sponsor
|
Cell source
|
Bioreactor
|
Clinical study/results
|
HepatAssist®
• Arbios Systems, Inc. (current)
• Circe Biomedical (
1998–2004)
•
Boston,
Massachusetts,
USA
|
Porcine,
Cryopreserved,
5–7×109
|
Hollow-fiber, two-compartment, dialysis-style cartridge
Oxygenation by perfusate
|
• Only Phase III randomized prospective study on BAL support
• 171 subjects randomized to BAL (n = 85) and standard medical care (control) (n = 86) with primary end point of 30-day survival.
• Overall survival: 71% BAL vs 62% control (p = 0.26)
|
ELAD®
• Vital Therapies, Inc. (current)
• VitaGen, Inc. (
1998–2003)
• Hepatix, Inc (pre-1998)
•
California,
USA
|
Human, tumour cell line C
3A
200–
400 g
|
Hollow-fiber, two-compartment, dialysis-style cartridge
Oxygenation by perfusate
|
• Randomized Phase I evaluation with 24 subjects in two groups (7 LTx listed, 17 not LTx listed)
• No significant differences in survival between ELAD-treated vs control
• Decreased deterioration in encephalopathy and improved galactose elimination in ELAD-treated subjects
|
MELS
• Charité, Campus Virchow-Klinikum,
Humboldt University,
Berlin,
Germany
|
Porcine/human.
Freshly isolated.
Up to
600 g.
|
Novel hollow-fiber, four-compartment arrangement with two perfusion paths and integral oxygenation fibers
|
• Phase I study
• Unique tripartite bioreactor design
• Seven subjects bridged to LTx, one subject died
• Well-tolerated by patients
|
BLSS
• Excorp Medical, Inc.
•
Minnesota,
USA
|
Porcine.
Freshly isolated.
70–
120 g.
|
Same as ELAD and HepatAssist®
|
• Phase I study, four subjects
• Significant ammonia, bilirubin reduction
• System well-tolerated by patients
|
AMC-BAL
•
Academic
Medical
Center,
University of
Amsterdam,
Holland
|
Porcine.
Freshly isolated.
10×109
|
Nonwoven mesh scaffold with oxygenation fibers
Direct perfusate–cell contact
|
• Phase I study, seven subjects
• Six bridged to LTx, one spontaneous recovery
• Ammonia reduction, hemodynamic stabilization, encephalopathy improvement
|
上表中,
最近的
Ⅰ期以上的临床研究报道于
2004年,目前只有零星的个例临床研究报道。在经历了
5、
6年的低迷后,生物人工肝的临床研究有开始复苏。美国的
ELAD
首先选择了
国内北京两家医院进行
Ⅰ期临床研究,据悉取得了延长患者生存时间、降低胆红素等效果(详细结果未见文献报道)。
2009年
ELAD又启动了随机、多中心、
Ⅱ期临床对照研究,计划扩展至美国和欧洲的
15个医疗机构。
BLSS正在
Pittsburgh医学中心进行
I/II期临床研究,计划将在美国的
6个医学中心以及中国完成
150例的
Ⅲ期临床研究。与此同时,由
HepaLife公司推出的
HepaDrive(
HepatAssist 的更新产品)也在美国开始了新的
Ⅲ期临床研究。美国三大公司的临床研究的强势推出,使得生物人
工肝的第二个春天值得期待。
3
难点与争议问题
3.1
现有细胞材料的选择
细胞来源是目前生物人工肝进一步临床研究与应用的“瓶颈”。人肝细胞为最佳选择,但来源缺乏,不适合肝移植的供肝仅能用于个例人工肝治疗。猪肝细胞功能与人肝细胞接近,但因种属差异,其分泌的蛋白等生物活性物质不能被人体利用,且有引起异种蛋白反应和传播动物源性传染病的可能性。肿瘤来源的肝细胞系来源广泛,具有正常肝细胞的某些功能,培养后能迅速达到人工肝治疗的数量需求。
C
3A细胞是此类细胞应用于生物人工肝的典型代表
,但一直未获
FDA批准,缘于其
潜在的致瘤危险性难以完成排除。这使得生物人工肝细胞材料的选择左右为难,相对而言,选用猪肝细胞的较多,目前也无严重不良事件的报道。
肝细胞永生化被认为是解决肝细胞源的可行性途径之一。迄今,国内外研究者通过转染
SV40LT、
hTERT等到原代肝细胞,建立了多株永生化肝细胞系,保持了肝细胞的生物特性和功能,但
SV40LT也存在潜在的致瘤性。日本学者曾经建立了一种可回复性切除
SV40LT的肝细胞永生化方法,以期能更安全使用永生化肝细胞系,但其切除
SV40LT的完全性难已确定,至今未见此类永生化肝细胞的应用研究报道。
3.2
干细胞的应用前景
如前所述,干细胞已成为生物人工肝细胞源研究的热点。无论是早期的胚胎干细胞(
ESc),还是新近出现的
iPS(
induced pluripotent stem cells),都引起了人工肝研究者的兴趣。尤其是间充质干细胞(
MSCs),因其也具有自我更新、增殖、多向分化的能力和特性,且来源方便、致瘤性低,自体
MSCs可避免免疫排斥,已被应用于多种疾病的组织修复治疗与研究中,包括治疗肝衰竭的动物与临床试验。
干细胞作为生物人工肝的细胞源在一定程度上涉及伦理问题,尤其是
ESc及
iPS,好在生物人工肝中的细胞被生物反应器的半透膜阻隔而并不进入患者体内,因此,伦理问题并非不可逾越。目前的难点是将
ESc、
iPS以及
MSCs诱导分化为肝细胞的技术尚未成熟,如何控制干细胞的增殖、分化并保持细胞表型的稳定?如何高效特异地使干细胞向肝细胞分化、减少非目的性分化?如何实现干细胞的三维高密度培养并形成组织样肝组织?这些都是干细胞用于生物人工肝所面临的挑战。
3.3
生物反应器的优化设计
近年来,围绕着为肝细胞提供良好的生长、代谢环境和为肝衰竭患者血液或血浆与肝细胞相互作用、进行物质交换提供理想的场所两大基本功能,在传统中空纤维生物反应器的基础上,一些新的生物反应器不断出现。但总体上讲,不同程度地存在着:不能为肝细胞提供更合适的微循环,缺少可靠有效的氧合作用,肝细胞代谢产物的无法排除,肝细胞培养与物质转运、交换欠佳,无免疫阻隔、实用性差等问题。如何实现反应器的优化设计仍然是
生物人工肝研究的重要任务,其中,既要充分考虑有利于
物质交换,又要
考虑
肝细胞
3D培养的微环境,同时还要
考虑到
代谢产物的排出,也要为实际使用中减少血容量而想。
3.4
生物人工肝的疗效
早有学者指出,由于肝衰竭发病机制至今尚不清楚,使得人们无法知道肝衰竭时最需要生物人工肝提供的治疗作用是什么,这既是涉及如何改进生物人工肝设计、功能的重要问题,也是如何提高肝衰竭疗效的关键点。就目前生物人工肝本身而言,仅以培养肝实质细胞为材料,绝对难以应对肝衰竭发病机制的复杂性,尤其是参与了免疫因素的重型肝炎。事实上,迄今生物人工肝对肝衰竭的治疗作用与机制尚未得到充分的研究与阐明。这些均制约和影响着生物人工肝治疗肝衰竭及其疗效的评价与提高。尽管,生物人工肝为等待肝移植提供过渡支持的效果已经显现,但这不应该成为生物人工肝唯一目标。如何提高、扩展生物人工肝的功能与作用,为肝衰竭患者提供关键兼全面的治疗作用必须加以重视。
3.5
生物人工肝的产业化
生物人工肝研究至今,产业化问题一直倍受关注。这是因为生物人工肝成为产品的难度甚大。首先,细胞材料要绝对安全,细胞所提供的肝功能要稳定、可靠、有效;其次,作为商业化的细胞产品要经的起保存、运输的考验;第三,使用者可能需要有让细胞进一步体外培养、增殖的技术和条件;第四,人工肝治疗过程中需要长时间保持细胞的活性与功能;第五,生物人工肝核心产品
—反应器产业化之前,存在进一步优化设计、放大及标准化等诸多问题。这些问题的解决均有较大的困难。
此外,生物人工肝尚存在产品定位的问题,这是因为,生物人工肝不同于任何其他药品和医疗仪器,它以活的细胞为材料,难以按常规处理。美国将生物人工肝列为医用组织工程产品(
tissue-engineered medical products
,
TEMP),欧洲
将生物人工肝视为高等医疗仪器(
advanced therapies medicinal products
,
ATMP),我国曾将
生物人工肝一分为二,肝细胞为生物细胞治疗产品,装置为血液净化类产品。提示,各国对生物人工肝的产业化均有严格的要求。
4
发展方向
4.1
以干细胞为主的混合细胞材料的应用
近来,随着
MSCs免疫调节功能的被证实,免疫调节作用成为其治疗肝损伤新的依据和机制。由于重型肝炎
/肝衰竭的发生源于因为复杂的免疫反应,使肝细胞大量坏死,导致肝衰竭,故如果将
MSCs用于生物人工肝,借助其免疫调节功能,在人工肝支持的过程中增加调整免疫的作用,这将拓展传统意义上以培养肝细胞为基础的生物人工肝支持的内涵。要想使
MSCs成为生物人工肝理想的细胞源,其诱导分化为肝细胞的潜能和特性必须同时加以利用。已有的研究显示,肝实质细胞有助于
MSCs的肝分化,
MSCs有助于原代肝细胞的功能维持,肝非实质细胞中的
kupffer细胞可能是
MSCs免疫调节的辅助细胞。因此,这三种细胞的混合共培养可能是
MSCs用于生物人工肝的可靠途径。
4.2
仿生型组织工程化生物反应器
我们在以往长期的生物人工肝研究中提出:用于人工肝支持系统的生物反应器,只有在结构上与正常肝脏最大的相似性,才能在培养肝细胞功能上产生出最大的相同性,从而最大程度地发挥肝功能替代和支持作用,实现这一目标的唯一途径,就是生物反应器的仿生型组织工程化设计与研究。
Gerlach等构建的三维
4腔编织型反应器是仿生型生物反应器的代表,肝细胞和非实质细胞在反应器内形成具有“胆小管”和“肝窦”样结构的肝组织,临床试验也取得良好的效果。能够摸仿“肝小叶”、“肝板”结构是生物反应器的发展方向,可谓生物反应器的终极目标,需要通过材料学、工程学、细胞学等多学科的发展而共同去实现。
4.3
混合型生物人工肝
混合生物人工肝是以培养肝细胞型生物人工肝为主,联合应用偏重于解毒的物理型、中间型人工肝技术与方法
,构成的一种复合型体外人工肝支持系统。旨在充分利用各种人工肝支持方法的优点,克服各自的缺点,满足临床肝衰竭患者人工肝辅助支持治疗所需的效果。混合型生物人工肝一直被认为是人工肝的发展方向,在国外
5种已进行临床研究的生物人工肝装置中,
HepatAssist即属混合型生物人工肝。它由活性炭吸附器与生物反应器组合而成,系统中血浆池内的血浆以较高速度循环于串连的活性炭吸附器和生物反应器,发挥机械祛毒与生物转化、补充的双重作用。正因如此,
HepatAssist的人工肝支持作用要更优一些。
4.4
可植入式生物人工肝
可植入式人工肝(
implanted artificial liver,IAL)是生物人工肝与组织工程相结合的产物,它更像组织工程肝组织,只是加入了生物反应器元素。如前述
Soto-Guti
é
rrez
等将鼠
ESc
、人肝非实质细胞共培养于小型
生物反应器
,经诱导分化后,通过外科手术
植入实验动物的体内,让其对肝衰竭动物进行肝功能的替代与支持治疗。由于
IAL省去了体外生物人工肝复杂的支持系统或装置,无需体外血液循环,大大降低发生凝血障碍的风险,故在使用上有明显的优点,有可能成为生物人工肝的一种新形式。据悉,日本研究者及公司正在致力于此类可植入式生物反应器的研发。
IAL对生物反应器的要求较高,目前尚不知采用可降解材料,还是在完成肝支持使命后再手术取出。如果是前者,就需要按组织工程肝组织来对待,其组织内的血管化则成为其研究与应用的
“
瓶颈
”
。
总之,生物人工肝已被认为是肝衰竭患者等待肝移植的“桥梁”,国外迄今为止的临床应用中,大多数都以支持过渡到肝移植为体现疗效的指标。相信随着有关基础研究的不断深入、工程技术的不断提高和交叉学科的不断发展,生物人工肝能够成为治疗肝衰竭可靠、有力的手段。
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