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肝癌组织中核因子κB的表达与肿瘤坏死因子α的相关性分析
http://www.ganbingzixun.com     点击数:6486     更新时间:2010-08-25    【查看评论
周伟民 平金良 钱福初 张国雷

【摘要】   目的   探讨核因子κ B NF- κ B )在肝癌组织中的表达特点及其与肿瘤坏死因子α( TNF α)、临床病理学特征的关系。 方法   以自身配对法收集手术后肝癌及其癌周组织各 30 份,以免疫组织化学法和酶联免疫吸附法检测肝癌和癌周组织中 NF- κ B 的定位和表达,并以酶联免疫吸附法定量分析肝癌和癌周组织中 TNF α的水平。样本均数间的比较先进行方差齐性检验,方差相等时进行 t 检验或方差分析;样本率之间的比较采用χ 2 检验;等级资料的比较采用秩和检验;相关性分析采用 Pearson 相关分析。用 Stata7.0 统计软件包处理、分析数据。 结果   NF- κ B 蛋白在肝癌组织的胞核和胞质中均有表达,而对应的癌周组织中仅在胞质中有表达; NF- κ B 表达的阳性率肝癌组织中为 100.0% ,癌周组织为 63.3% ,χ 2 13.47 P<0.01 ,差异有统计学意义。 NF- κ B 表达强度:肝癌组织( + 4 例、( ++ 10 例、( +++ 16 例,癌周组织( - 11 例、( + 7 例、( ++ 9 例、( +++ 3 例,肝癌组织中 NF- κ B 的表达强度明显高于其对应的癌周组织, u 4.44 P<0.01 ,差异有统计学意义。核蛋白 NF- κ B 的表达水平,肝癌组织中大约是癌周组织的 1.9 倍, t 23.17 P<0.01 ,差异有统计学意义。 TNF α的表达水平在肝癌组织中大约是癌周组织的 2.3 倍, t 39.22 P<0.01 ,差异有统计学意义。核蛋白 NF- κ B TNF α的表达呈显著正相关, r 0.964 t 19.31 P<0.01 。肝癌组织中核蛋白 NF- κ B 的表达水平与肿瘤的分化程度、肿瘤数目、肿瘤大小和 HBsAg 是否阳性未见明显的相关性,各组间的差异无统计学意义。 结论   TNF α可诱导 NF- κ B 活化,进入细胞核内参与肝癌的发生和发展。

【关键词】   癌,肝细胞; 核因子κ B 肿瘤坏死因子α; 相关性分析

 

Expression characteristics of nuclear factor kappa B in hepatocellular carcinoma tissues    ZHOU Wei-min, PING Jin-liang, QIAN Fu-chu, ZHANG Guo-lei. Department of General Surgery, Huzhou Central Hospital, Huzhou Zhejiang 313000, China

Email: littlerat2156@ 163.com

Abstract Objective     To investigate the expression characteristics of nuclear factor kappa B (NF- κ B) in hepatocellular carcinoma (HCC) tissues and its correlation with tumor necrosis factor alpha (TNF α ) and clinical pathological features. Methods     Thirty liver specimens from HCC patients were collected by self-control method. The localization and expression of NF- κ B in HCC and their surrounding tissues were detected by immunohisto-chemistry and enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), respectively. And the levels of TNF α in these tissues were analyzed by ELISA. Results     The expressed NF- κ B was localized in nucleus and cytoplasm in HCC, whereas only in cytoplasm in the surrounding tissues. The expression level and density of NF- κ B in HCC tissues were obviously higher than those in the surrounding tissues (P < 0.01), which was positively correlated with increased TNF α in HCC tissues (r = 0.964, P < 0.01). No positive correlation was found between NF- κ B expression and histological differentiation grade, number of tumor, size of tumor, and HBsAg positive (P > 0.05). Conclusion     The expression and localization of NF- κ B in HCC tissues are obviously different from those in the surrounding normal liver tissues, and the level of nucleoprotein NF- κ B in HCC tissues is correlated with expressed TNF α , suggesting that TNF α can activate NF- κ B, the activated NF- κ B then translocates to the nucleus and plays important role in the carcinogenesis of HCC.   

Key words Carcinoma, hepatocellular;   Nuclear factor kappa B;   Tumor necrosis factor alpha;    Correlation analysis

肝癌( HCC )的发生、发展是一个多基因、多阶段的过程,涉及到多种细胞因子、生长因子及其相关信号通路的异常。核因子κ B nuclear factor- κ B NF- κ B )是具有多向性调节作用的转录因子,可调控多种基因、细胞因子及生长因子的转录表达,参与调控体内多种生理和病理过程 [1] 。在胚胎期, NF- κ B 能保护肝脏细胞抵抗肿瘤坏死因子α( TNF α)等诱导的凋亡。在肿瘤发生时, NF- κ B 信号途径被激活,活化的 NF- κ B 能通过其抗凋亡效应保护恶性细胞,从而在恶性肿瘤的发生、发展中起重要的作用 [2] TNF α是一种与炎症和肿瘤发生密切相关的细胞因子,研究显示 TNF α能激活 NF- κ B ,抑制恶性细胞的凋亡,从而参与了肿瘤的发生和发展 [3] 。我们以免疫组织化学法和酶联免疫吸附法( ELISA )检测肝癌及其癌周组织 NF- κ B 的表达特点,以 ELISA 定量分析该组织中 TNF α的表达水平,并分析 NF- κ B 表达与 TNF α及临床病理学特征间的关系,探讨 NF- κ B TNF α在肝癌研究中的临床价值。

资料与方法

一、研究对象

按自身配对法收取湖州市中心医院 2006-2008 HCC 患者 30 例,男 24 例,女 6 例,年龄 36 65 岁,平均 47 岁。术后新鲜肝脏组织,分别留取癌灶、癌周组织(距癌灶 < 5cm ,均为正常肝组织)各 30 份,部分组织经 4% 中性甲醛溶液固定、石蜡包埋保存,余组织 -80 保存。 HCC 患者标本经病理学证实均为肝细胞肝癌,其中高分化 7 例、中分化 17 例和低分化 6 例。 HBsAg 阳性 24 例,阴性 6 例;肿块直径≥ 5cm 7 例, < 5cm 23 例;肿瘤单发 25 例,≥ 2 5 例。

二、方法

1. 免疫组织化学检查:兔抗人 NF- κ B 第一抗体及 SP 免疫组织化学试剂盒购自中国武汉博士德公司。免疫组织化学检查采用经典 SP 法进行,以 0.01mol/L 磷酸盐缓冲液( pH 7.5 )分别替代第一、二抗体和 SP 试剂作阴性对照,以已知表达 NF- κ B 的肝癌组织做阳性对照。组织中显示棕黄色颗粒为 NF- κ B 表达阳性,以阳性细胞数≥ 10% 作为阳性判断标准,肝组织中 NF- κ B 表达强度可分为:( + ),阳性细胞数为 10% 25% ;( ++ ),阳性细胞数为 26% 75% ;( +++ ),阳性细胞数为 76% 100%

2. 细胞核蛋白抽提及 NF- κ B 的定量分析:称取肝组织约 60mg ,剪成碎片至灭菌的匀浆器中,根据核蛋白与浆蛋白抽提试剂盒(购自中国碧云天生物技术研究所)说明书提取细胞核蛋白,方法主要为:加入适量的组织匀浆液(由浆蛋白抽提试剂 A B 和苯甲基磺酰氟按一定比例配制而成),冰浴中充分匀浆,离心后弃上清液,再加入含有苯甲基磺酰氟的浆蛋白抽提试剂 A ,震荡和冰浴后加入试剂 B ,再次震荡冰浴离心,吸弃上清液(即为浆蛋白),此时加入含苯甲基磺酰氟的核蛋白抽提试剂,反复震荡冰浴共 30min ,离心吸取上清液即为核蛋白, -80 保存备用。蛋白浓度测定以 BCA 法进行。参照 ELISA 试剂盒(购自美国 ADL 公司)说明书定量检测核蛋白中 NF- κ B 的水平,结果以 NF- κ B/ 核蛋白( ng/mg )来表示。

3. 肝组织中 TNF α的检测:称取肝组织约 60mg ,剪成碎片至灭菌的匀浆器中,加入 1ml 磷酸盐缓冲液,冰浴充分匀浆, 3000r/min 离心 10min ,吸出上清液,以 ELISA 法定量检测 TNF α的水平,操作步骤严格按照 ELISA 试剂盒(购自美国 ADL 公司)说明书进行,结果以 TNF α / 肝组织( pg/mg )来表示。

4. 统计学处理 : 数据以均数±标准差( x- ± s )表示,样本均数间的比较先进行方差齐性检验,方差相等时进行 t 检验或方差分析;样本率之间的比较采用χ 2 检验;等级资料的比较采用秩和检验;相关性分析采用 Pearson 相关。用 Stata7.0 统计软件包处理、分析数据。 P<0.05 表示差异有统计学意义。

   

1. 肝癌及癌周组织中 NF- κ B 的表达和定位分析:免疫组织化学显示肝癌及其癌周组织中 NF- κ B 阳性表达呈棕黄色。肝癌组织中 NF- κ B 蛋白呈条索状、巢状分布,胞核和胞质均呈阳性着色,胞核着色较深,偶见深染颗粒(图 1A ),而对应的癌周组织中 NF- κ B 蛋白主要定位于胞质,着色较淡,胞核基本无阳性着色(图 1B )。 NF- κ B 表达的阳性率 30 例肝癌组织中为 100.0% ,癌周组织为 63.3% ,χ 2 13.47 P<0.01 ,差异有统计学意义。

NF- κ B 表达强度:肝癌组织( + 4 例、( ++ 10 例、( +++ 16 例,癌周组织(-) 11 例、( + 7 例、( ++ 9 例、( +++ 3 例,肝癌组织中 NF- κ B 的表达强度明显高于其对应的癌周组织, u 4.44 P<0.01 ,差异有统计学意义。肝癌组织中 NF- κ B 表达强度较高,强阳性共 16 例占 53.3% ,而癌周组织中强阳性仅 3 例,且有 11 例未见 NF- κ B 表达。

2. 肝癌及其癌周组织中 NF- κ B TNF α的定量检测:肝癌及癌周组织中核蛋白 NF- κ B TNF α的表达均存在明显差异。核蛋白 NF- κ B 的表达肝癌组织中为 60.47 ± 12.52 ,癌周组织为 31.09 ± 6.33 ,核蛋白 NF- κ B 的表达水平肝癌组织中大约是癌周组织的 1.9 倍, t 23.17 P<0.01 ,差异有统计学意义。 TNF α的表达在肝癌组织为 82.32 ± 17.05 ,癌周组织为 36.41 ± 13.06 TNF α的表达水平在肝癌组织中大约是癌周组织的 2.3 倍, t 39.22 P<0.01 ,差异有统计学意义。核蛋白 NF- κ B TNF α的表达呈显著正相关, r 0.964 t 19.31 P<0.01

3. 肝癌组织中 NF- κ B 的水平与临床病理学特征的相关性分析:肝癌组织中核蛋白 NF- κ B 的表达水平与肿瘤的分化程度、肿瘤数目、肿瘤大小和 HBsAg 是否阳性未见明显的相关性,各组间的差异无统计学意义。肝癌组织中 NF- κ B 水平与临床病理学特征的相关性分析见表 1

   

NF- κ B 是一种能与免疫球蛋白κ轻链基因的增强子κ B 序列特异性结合的蛋白质因子,具有广泛生物学活性,能与多种基因的启动子或增强子序列的特定位点结合而促进其转录和表达,调控多种细胞因子、生长因子的转录,参与细胞增殖与凋亡的调节,并且能直接影响细胞周期或 DNA 复制,从而参与调控体内多种生理和病理的过程,在感染、炎症反应、氧化应激、细胞增生与凋亡等过程中发挥重要作用。 NF- κ B 能调控多种基因的表达,它是抗凋亡基因表达的主要激活子,活化的 NF- κ B 能诱导恶性肿瘤细胞抵抗凋亡,并能调节肿瘤血管生成与侵袭能力。因此, NF- κ B 信号通路的活化与恶性肿瘤的发生、进展、转移和耐药密切相关 [1, 4]

通常情况下, NF- κ B 主要是与它的抑制蛋白( I κ B )结合而以无活性的形式存在于胞质中。当受到细胞因子、有丝分裂原、病毒等刺激后, I κ B α通过磷酸化、泛素化而被蛋白酶体降解,游离的 NF- κ B 二聚体进入到细胞核内,与靶基因的κ B 位点结合,发挥其转录调节作用 [4] 。免疫组织化学结果显示肝癌组织中 NF- κ B 定位于胞核和胞质,而对应的癌周组织中仅在胞浆有 NF- κ B 阳性着色; NF- κ B 的表达水平和表达强度在肝癌组织明显高于癌周组织。提示 HCC 发生时 NF- κ B 信号途径被激活,大量活化的 NF- κ B 进入细胞核内发挥转录调节作用,从而参与 HCC 的发生和发展。

HCC 是炎症相关性的肿瘤,持续肝炎病毒感染导致肝脏慢性炎症是 HCC 发病的主要背景。炎症介质和病毒癌基因均可激活 NF- κ B 信号通路,调节靶基因的表达,促进肝细胞恶性转化,抑制异型细胞凋亡,从而在肝细胞慢性炎症与癌变之间起桥梁作用 [5] 。研究显示 HBV HCV 核心蛋白能激活 NF- κ B ,不但能促进感染细胞的存活,使 HBV HCV 逃避免疫清除,并且能抵抗恶性细胞的凋亡,使癌细胞获得有利的生长条件 [6] 。因此,在肝炎病毒持续感染至 HCC 形成的过程中, NF- κ B 信号通路活化起着重要的作用。本研究的实验对象中 HBsAg 的阳性率高达 80% ,但是对照临床资料分析显示:肝癌组织中 NF- κ B 的表达与 HBsAg 是否阳性未见明显相关性,且与肿瘤的分化程度、肿瘤数目、肿瘤直径均未见明显统计学差异。 HBsAg 阳性并不能代表 HBV 处于活动状态,因为 HBxAg 才是激活 NF- κ B 的主要活性物质 [7-8] HBV DNA 是病毒复制和传染性的直接标志,因此探讨 NF- κ B 的表达与 HBV DNA 的关系更有意义。

在众多能激活 NF- κ B 信号通路的炎症介质中, TNF α是重要的一种。作为一种致炎性细胞因子, TNF α主要由活化的巨噬细胞分泌产生,也可由肿瘤细胞产生。在慢性肝炎、肝癌患者血清 TNF α水平明显上升。本研究中肝癌组织 TNF α的水平明显高于癌周组织,且与肝癌组织中升高的核蛋白 NF- κ B 呈显著正相关,这与 TNF α和 NF- κ B 之间的正反馈调节机制是吻合的。 TNF α的转录受 NF- κ B 的调控,并且它又以自分泌或旁分泌的方式作用于细胞, TNF α在诱导细胞凋亡的同时激活了 NF- κ B ,促使细胞建立快速防御机制,发挥抗凋亡作用,从而产生正反馈机制,放大了 NF- κ B 的效应,使得 TNF α激活 NF- κ B 所介导的抗凋亡效应占据优势地位,从而促进了恶性肿瘤的发生和发展 [9] 。肝癌组织中 TNF α和 NF- κ B 的水平呈正相关,提示 TNF α可激活了 NF- κ B 信号通路,从而参与炎症相关性 HCC 的发生和发展。在小鼠淤胆型肝炎致肝癌的模型中,抗 TNF α抗体可以从源头阻断 NF- κ B 的活化,促使异型肝细胞发生凋亡,肝细胞癌变进程受到抑制 [10] ,提示抗 TNF α抗体能用于炎症相关性肝癌的治疗,这也间接证实了 TNF α对 NF- κ B 的激活作用与 HCC 发生和发展密切相关。

恶性肿瘤的发生发展除了细胞增殖失控外,另一个重要的原因是恶性细胞不能正常地凋亡, NF- κ B 恰恰具有加速细胞周期进程,抵抗细胞凋亡的能力。研究显示活化的 NF- κ B 可促进 TNF 受体相关因子 1 2 、凋亡抑制因子 1 2 等的表达,这些基因产物相互协同可在早期抑制 TNF α及抗癌药物诱导的细胞凋亡 [11] ;同时 NF- κ B Caspase-8 的直接阻断作用而抑制 Caspase 的级联活化也是其抗细胞凋亡的重要机制 [12] 。细胞周期素 D NF- κ B 下游的靶基因, NF- κ B 通过直接或间接促进细胞周期素 D 的表达促使细胞周期从 G1 期向 S 期转化,使细胞增殖失控从而参与肿瘤的发生和发展 [13] 。抑制 NF- κ B 信号通路后,细胞周期素 D1 的表达减少,细胞周期停滞在 G1 期,肝癌细胞的生长明显受到抑制,提示 NF- κ B 活化与细胞周期紊乱密切相关 [14]

HCC 发生机制复杂,涉及了许多基因、蛋白、大量细胞因子及其信号途径的异常, TNF α是其中一个重要的细胞因子,而 NF- κ B 则是该网络的中心环节。在肝癌组织中, TNF α可能激活了 NF- κ B 信号通路,活化的 NF- κ B 进入细胞核内,参与炎症相关性 HCC 的发生发展,对其进行干预有望成为 HCC 治疗的新方向。

     

[1]Okamoto T, Sanda T, Asamitsu K. NF-kappa B signaling and carcinogenesis. Curr Pharm Des, 2007, 13: 447-462.

[2]Cavin LG, Venkatraman M, Factor VM, et al. Regulation of alpha-fetoprotein by nuclear factor-kappaB protects hepatocytes from tumor necrosis factor-alpha cytotoxicity during fetal liver development and hepatic oncogenesis. Cancer Res, 2004, 64: 7030-7038.

[3]Szlosarek P, Charles KA, Balkwill FR. Tumour necrosis factor-alpha as a tumour promoter. Eur J Cancer, 2006, 42: 745-750.

[4]Inoue J, Gohda J, Akiyama T, et al. NF-kappaB activation in development and progression of cancer. Cancer Sci, 2007, 98: 268-274.

[5]Elsharkawy AM, Mann DA. Nuclear factor-kappa B and the hepatic inflammation- fibrosis-cancer axis. Hepatology, 2007, 46: 590-597.

[6]Mozer-Lisewska I, Kaczmarek M, Zeromski J. The role of NF-kappaB transcription factor in chronic viral hepatitis C and B. Postepy Biochem, 2006, 52: 56-61.

[7]Zhang X, Zhang H, Ye L. Effects of hepatitis B virus X protein on the development of liver cancer. J LabClin Med, 2006, 147: 58-66.

[8]Chan DW, Ng IO. Knock-down of hepatitis B virus X protein reduces the tumorigenicity of hepatocellular carcinoma cells. J Pathol, 2006, 208: 372-380.

[9]Karin M. Nuclear factor-kappa B in cancer development and progression. Nature, 2006, 441: 431-436.

[10]Pikarsky E, Porat RM, Stein I, et al. NF-kappa B functions as a tumour promoter in inflammation-associated cancer. Nature, 2004, 431: 461-466.

[11]Varfolomeev E, Goncharov T, Fedorova AV, et al. c-IAP1 and c-IAP2 are critical mediators of tumor necrosis factor alpha (TNFalpha)-induced NF-kappaB activation. J Biol Chem, 2008, 283: 24295-24299.

[12]Lamkanfi M, Declercq W, Vanden Berghe T, et al. Caspases leave the beaten track: caspase-mediated activation of NF-kappaB. J Cell Biol, 2006, 173: 165-171.

[13]Park SG, Chung C, Kang H, et al. Up-regulation of cyclin D1 by HBx is mediated by NF-kappaB2/BCL3 complex through kappaB site of cyclin D1 promoter. J Biol Chem, 2006, 281: 31770-31777.

[14]Ozaki I, Zhang H, Mizuta T, et al. Menatetrenone, a vitamin K2 analogue, inhibits hepatocellular carcinoma cell growth by suppressing cyclin D1 expression through inhibition of nuclear factor kappaB activation. Clin Cancer Res, 2007, 13: 2236-2245.

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