关键词】肝炎病毒,乙型;
病毒复制;
X
蛋白
Regulation of hepatitis B virus replication regulated by HBX protein
WANG Jun-zhong, YANG Dong-liang.
【
Key words
】
Hepatitis B virus;
Virus replication;
X protein
【
First author’s address
】
Division of Clinical Immunology, Tongji Hospital, Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, China
Corresponding author: YANG Dong-liang, Email: dlyang@tjh.tjmu.edu.cn
乙型肝炎病毒
X
蛋白(
hepatitis B virus X protein
,
HBx
)由一段
154aa
的多肽组成,由
HBV
的
X
基因编码,在肝癌的形成中起重要作用,并且广泛参与宿主细胞的基因表达、反式激活和细胞信号传导等
[1]
。
HBx
不能直接与
DNA
结合,但是能活化多种
DNA
顺式作用元件,如核因子κ
B
、激活蛋白
1
、
激活蛋白
2
、
CCAAT
增强子结合蛋白、活化转录因子
/cAMP
反应元件结合蛋白等。
HBx
还能与某些基础转录组件作用,如转录因子Ⅱ
B
、转录因子Ⅱ
H
、
RNA
多聚酶的亚基和
TATA
结合蛋白等。通过这些靶结构,
HBx
可反式激活多种细胞基因的转录。另外,在细胞质内,
HBx
还能刺激多种细胞内信号转导通路,包括
Ras/Raf
丝裂原启动的蛋白激酶、
c-Jun
激酶、
JAK/STAT
激酶
C
等
[2]
。
一、
HBx
调节
HBV
的活跃复制
在转基因小鼠中,
X
基因缺失突变后病毒的复制水平和持续时间没有明显变化,但是用表达
HBx
的转基因小鼠和
HBV
转基因小鼠杂交,其后代病毒复制的水平和持续时间均有明显提高
[3]
。土拨鼠肝炎病毒(
woodchuck hepatitis virue
,
WHV
)的基因组和
HBV
极为相似,
Zhang
等
[4]
发现,
X
基因缺失或突变的
WHV
活性减弱,感染土拨鼠后只能产生较低水平的病毒血症。
Bouchard
等
[5]
将
HBx
表达缺失的感染性克隆
HBV
[
HBV
(
-HBx
)]转染
HepG2
细胞后,病毒的复制水平下降了
95%
。如将
HBV
(
-HBx
)和
HBx
表达质粒共转染,病毒的复制将回复到与野生型相当的水平,而
HBx
与野生型
HBV
感染性克隆共转染对病毒的复制没有明显的影响。
Keasler
等
[6]
利用小鼠尾静脉高压注射模型证实,小鼠肝脏内
HBV
的复制
75%
是
HBx
依赖性的,
25%
是
HBx
非依赖性的。
HBx
表达缺失时,肝脏内
HBV
的
3
种
RNA
(
3.5kb
、
2.4kb
、
2.1kb
)平均下降
72%
,核心蛋白的表达也显著下降,而外周血中
HBV
滴度则下降了
99%
。在人肝细胞嵌合小鼠中,接种
HBx
缺失突变的
HBV
不能产生病毒血症;如果同时接种
HBx
表达质粒,则能产生高水平的病毒血症
[7]
,这也证实了
HBx
是
HBV
在人肝细胞中活跃复制所必需的。
二、
HBx
调节
HBV
复制的机制
HBx
在
HBV
生命周期中起着重要的调节作用,但是
HBx
调节病毒复制的机制还不清楚,可能的机制包括以下几种。
1
.
Ca2+-
富含脯氨酸的酪氨酸激酶
2
(
proline-rich tyrosine kinase 2
,
Pyk2
)
/
局部黏附激酶(
focal adhesion kinase
,
FAK
)
-Src
途径:
HBx
调节
HBV
复制是细胞质内钙离子依赖性的。
HBx
能与线粒体膜上的渗透性转换孔作用,增加细胞质内的
Ca2+
浓度。在
HepG2
细胞中,
HBx
缺失表达时,
HBV
的复制水平显著下降,用
Ca2+
激动剂刺激细胞增加细胞质内的
Ca2+
水平,能使
HBV
的复制回复到野生型水平。相反,野生型
HBV
感染性克隆转染
HepG2
细胞后,同时用线粒体
Na+-Ca2+
泵抑制剂减少细胞质内
Ca2+
浓度,野生型
HBV
的复制水平与
HBx
表达缺失时相当
[5
,
8-9]
。
Pyk2
和
FAK
是细胞质内的非受体酪氨酸激酶,在
Ca2+
的调节作用下发生磷酸化而被激活。
Bouchard
等
[5]
发现,
HBx
通过调节细胞质内
Ca2+
水平激活
Pyk2
和
FAK
,进而促进
HBV
的复制。在
HepG2
细胞中,分别用
Pyk2
抑制剂和突变型的
FAK
刺激后,野生型
HBV
的复制下降了
15
倍以上,和
HBx
缺失的
HBV
复制水平相当
[5
,
10]
。
Pyk2
和
FAK
磷酸化后能与能激活下游的
Src
激酶,而
Src
激酶的活化是
HBV
活跃复制所必需的。研究结果发现,当
HBx
表达缺失时,
Src
激酶不能活化,
HBV
的复制水平也显著下降。用野生型的
HBV
感染性克隆转染肝癌细胞,并同时阻断
Src
激酶的活化,其复制水平与
HBx
缺失突变型相当。另外,
HBx
还能通过活化
Src
激酶激活下游的
Ras-Raf-
丝裂原活化蛋白激酶
-c-Jun
氨基末端激酶信号通路,调节细胞周期和促进病毒复制
[2]
。这表明,
HBx
通过调控细胞质中的
Ca2+
水平,激活
Pyk2/FAK-Src
酪氨酸激酶及其下游信号通路,促进
HBV
的复制。
2
.损伤
DNA
结合蛋白(
dameged DNA binding protein
,
DDB
)
1
结合途径:紫外线损伤
DNA
结合蛋白由
DDB1
和
DDB2
两个亚基构成,其中
DDB1
与
HBx
的适当结合是产生病毒感染和复制所必需的。
Sitterlin
等
[11]
构建
X
基因突变的
WHV
感染性克隆,使
HBx
与
DDB1
的结合增强或减弱,将这种突变的
WHV DNA
注射到土拨鼠肝脏内,不能产生病毒血症或延迟产生较弱的病毒血症。
Leupin
等
[12]
构建了一系列突变型的
X
基因表达载体,其表达的
HBx
与
DDB1
的结合有不同程度的降低。用这些
HBx
表达载体与
HBV
(
-HBx
)共转染
HepG2
细胞,病毒的复制较
HBV
(
-HBx
)有所增加,但均不能达到野生型的水平。其中,
HBx
第
96
位氨基酸突变时,
HBx
不能和
DDB1
结合,与
HBV(-HBx)
共转染后也不能提高病毒的复制。但是将
96
位氨基酸突变的
HBx
和
DDB1
融合表达,再与
HBV
(
-HBx
)共转染,能显著提高病毒的复制水平。另外,
DDB1
位于细胞核,
HBx
与
DDB1
结合并调节
HBV
的复制也主要发生在细胞核。
Leupin
等
[12]
分别在野生型的
X
基因上添加核定位信号和核排除信号,核定位信号
-X
与
HBV
(
-HBx
)共表达时能使病毒的复制回复到野生型水平,而核排除信号
-X
与
HBV
(
-HBx
)共表达时对病毒的复制没有影响。最近有研究还发现,用
RNA
干扰技术分别阻断
HBx
和
DDB1
的表达均能抑制
HBV
的复制,同时阻断两者的表达后,
HBx
的稳定性下降,抑制病毒复制的水平也大大增加
[13]
。
3
.蛋白酶体途径:蛋白酶体是一类存在于细胞内的蛋白水解体系,
HBx
在细胞内作为一种外来蛋白,是蛋白酶体的作用底物。研究结果发现,
HBx
能与蛋白酶体的两个亚基
XAPC7
和
XAPC1
结合,这种结合可能是
HBx
发挥功能所必需的,用蛋白酶体抑制剂能阻断
HBx
的反式激活转录功能,而
XAPC7
和
XAPC1
的高表达能使其反式激活转录功能增强。
Zhang
等
[14-15]
将
WHV
(
-HBx
)和
HBV
(
-HBx
)转染
HepG2
细胞,同时用蛋白酶体特异性的抑制剂处理细胞,能使
WHV
(
-HBx
)和
HBV
(
-HBx
)的复制恢复到野生型水平,而野生型
WHV
和
HBV
复制没有改变,这提示蛋白酶体能调节
HBV
的复制,并且这种调节是
HBx
依赖性的。研究结果还发现,
HBx
与蛋白酶体的两个亚基
XAPC7
和
XAPC1
之间的结合具有竞争抑制关系,
HBx
与
XAPC7
和
XAPC1
结合后蛋白酶体降解蛋白的活性显著下降,所以
HBx
和蛋白酶体调节
HBV
复制的可能机制是在病毒的组装过程中,
HBx
与蛋白酶体结合后抑制了蛋白酶体对病毒核衣壳的降解,从而促进病毒的复制和抑制细胞的抗病毒作用。
HBx
是
HBV
活跃复制所必需的,但具体机制还不清楚,
HBx
是否影响
HBV RNAs
的生成也存在争议
[5
,
12]
,有待进一步研究。
参
考
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献
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