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治疗性克隆—面临的机遇与挑战
http://www.ganbingzixun.com     点击数:6616     更新时间:2009-11-14    【查看评论

贾战生,王春雨,魏欣,白雪帆

一、治疗性克隆概述 概念性

治疗性克隆( therapeutic cloning)是生命科学领域发展最快的前沿学科,是体细胞核移植技术和最新的人胚胎干细胞技术结合的产物,将成为人类医疗历史上革命性的技术。当前,治疗性克隆的基本步骤是:取病人或健康人的躯体细胞,如皮肤细胞、骨髓间充质干细胞、成纤维细胞等,作为核供体,移植入去核的人卵母细胞获得克隆胚胎;然后从克隆胚胎提取并分离胚胎干细胞,建立个体化的胚胎干细胞库;再根据需要诱导该细胞分化成所需要的各种类型的细胞,或克隆需要移植的器官,以用于疾病的治疗和维持机体健康 [1,2] 。附治疗性克隆技术路线图。

目前已报道,将产生多巴胺的神经元细胞用于治疗帕金森症 [3] ,将产生胰岛素的胰岛细胞治疗糖尿病病人 [4] 。从理论上来说由于使用的是患者自身的细胞生产出来的治疗用细胞,移植这些细胞到患者体内将不会产生免疫排斥反应。另一方面,每年都有数以百万计的患者需要细胞、组织的修复或者器官移植,由于胚胎干细胞可以无限传代,在数量上可以保证治疗的需要,从而解决可供移植的细胞、组织和器官

来源严重不足的瓶颈问题 [5] ,为人类健康和长寿提供了新的希望。

近年来,利用核移植技术和胚胎干细胞技术相继建立了人 核移植胚胎干( nuclear transfer embryonic stem cellntES)细胞系和人-兔异种间 ntES细胞。这 2项阶段性研究成果的取得,标志着治疗性克隆研究的巨大进步。 2004-04,《 Science》上发表了韩国科学家 Hwang [6] 通过核移植技术获得了人-人 ntES细胞。他们以健康女性志愿者的体细胞为核供体,以其自身卵母细胞为受体。在 30枚核移植囊胚中,得到 20个内细胞团( ICMs),建成 1株人 ntES细胞系,可传代培养 70 代以上。上海第二医科大学盛惠珍研究小组 [7]在国际上首次构建了人-兔核移植重构胚。分别将 54252604个年龄组的人皮肤成纤维细胞核移入去核兔卵母细胞内,获得 ntES细胞,通过原位杂交、免疫组化、核型和同源基因分析等证实 ntES细胞具有人源性,并且

保持干细胞的未分化特性,能形成类胚体,在一定诱导条件下可以分化为神经、肌肉等 3个胚层的细胞群。 2005-06,汉城国立大学的研究者 [8]以病人的皮肤细胞为供体,以志愿者捐赠的卵母细胞为受体,利用体细胞核移植技术成功建立 11株人核移植胚胎干细胞,这些细胞具有多能性,染色体正常,与供核病人的 DNA一致、组织相容性抗原一致。

二、治疗性克隆 的研究意义与应用前景

应用治疗性克隆技术获得的产物 -人核移植胚胎干 nuclear- transferred embryonic stemntES)细胞,同 ES 细胞一样,在 生物医学领域有着广阔的应用前景和科学研究价值, 为临床治疗学、细胞生物学、生物发育学、比较动物学等研究提供研究材料和方法。

(一)           临床疾病的治疗与维持老年人的身体健康延年益寿  

1.        作为细胞治疗的“种子细胞

ntES 细胞与普通的细胞移植治疗相比,具有革命性的进步。它以患者的体细胞为核供体,通过核移植技术获得的 ntES细胞,与病人的遗传物质相同,可以消除受体对供体的免疫排斥反应,这种 个体化的人 ntES 细胞,可为多种疾病的治疗和人工器官的克隆提供理想的“种子细胞”。当前, 临床上有许多疾病,如帕金森病、老年痴呆症、糖尿病、肝硬化、肾衰竭、心脏病、血液病、肿瘤、颅脑或脊髓损伤、皮肤烧伤等,亟待通过细胞、组织 /器官移植来治疗。据 美国疾病控制中心( 2001年)估计,每年约有 300000死于可用干细胞治疗的疾病。在中国, 目前约有 100万至 150万人需要通过器官移植治疗疾病,但由于受到供体器官来源的限制,每年仅能实施手术 1.3万例;还有 400万名白血病患者在等待骨髓移植,而全国骨髓库的资料才 3万份,绝大多数病人在等待中死去。

已经应用 ntES细胞在体内外分化成多种细胞,包括神经细胞和生殖细胞 [9,10]。尤其 Barberi [9]建立了一套方法,能使 ntES细胞向中枢神经系统细胞特定分化,能产生高效率的神经胶质细胞、寡突细胞、神经元细胞,包括多巴胺能神经元、 γ-氨基丁酸能神经元等,将分化的多巴胺能神经元移植到 Parkinson 病模型后,能改善其症状。 细胞治疗的途径有两种:其一, nt ES 细胞定向分化后移植。细胞扩增后,体外定向分化,对分化细胞进行纯化,将获得的目的细胞移植到病变部位,替代丧失功能的部分细胞;其二, ntES细胞原位移植。与定向分化后相比, ntES细胞原位移植有以下缺点: 没有经过纯化,可能将污染的异源饲养层细胞带进移植部位; ntES 细胞没有转入经选择基因,无法控制植入细胞的命运,可能发生癌变; ntES 细胞分化成份复杂,目的细胞分化成份少,可能出现大量非必须细胞的分化。

2 维持老年人的身体健康延年益寿

应用该项技术获得的 ntES细胞或细胞产物,可以使老年人维持身体健康,恢复青春活力,有 延年益寿功效;对于正在重要岗位上的人,可以为自己的健康提前“投资”,在年轻时提供健康的躯体细胞,预先建立自体 ntES细胞,储存于该细胞库,以备后用。据 英国《苏格兰人报》 619日披露,俄罗斯巨富们在将他们的投资从奢侈华贵和珠宝首饰转向一种干细胞美容,这种干细胞是从流产胎儿身上提取干细胞,注射到人体可以保证青春永驻。 据称,胎儿干细胞治疗方法不仅被用于平复皱纹,还被注入人体其他部位,以去除脂肪团和皮肤松弛。这种胎儿干细胞来源受到各国伦理和法律的限制,但是应用治疗性克隆技术获得的个体特异性 ntES细胞,并经过一定的诱导分化,用于治疗符合相关的法规和伦理。

(二) 细胞生物学  

通过研究 ntES细胞的体外分化特性,可以识别某些靶基因,对人类新基因的发现,功能基因的研究,以及基因治疗的研究均有重要意义。通过探讨 ntES细胞体外增殖和分化的机制,了解各种生长和分化因子的作用,为组织再生和修复的研究提供了新的工具;通过诱导 ntES细胞癌变,可分析肿瘤细胞发生的分子机理。 ntES 细胞作为一种得天独厚的研究材料,对于阐明细胞增殖、分化、凋亡、迁徙、恶变等机制有着重要意义。自发现 ES细胞以来,人们已经利用 ES细胞建立了多种细胞类型的体外分化系统,体外分化的多种细胞类型都曾被成功的植入胎鼠或成体鼠,在受体鼠体内形成有功能的细胞群。

(三)发育生物学  

由于哺乳动物在母体内受胚胎发育的个体大小和内环境条件的限制,很难系统地研究其早期的发育进展、细胞分化及调控机理等。 比较动物卵母细胞质对同种或异种细胞核发育的影响 ,在细胞和分子水平上为研究哺乳动物胚胎早期发育的调控机制提供了良好的材料和方法,也为研究胚胎发育的影响因素提供了便利条件。建立在 ES细胞和基因打靶技术基础上的复杂的转基因系,使人们可以建立有效的分析系统,从而在分子水平上研究不同的生物学问题。它不仅可以将一些在发育过程中对动物体非必需或可被替代的特定基因进行敲除 (gene knock-out),在体内进行功能缺失研究,而且还可以研究基因在不同发育时期中的作用。 ntES细胞作为一种体外细胞系,提供了一个研究处理整体细胞群的实验体系。因此,就有可能人为地产生一些基因突变,如对胚胎致死性基因的研究等,也可利用这些突变的基因来克隆产生转基因小鼠,从而建立了基因突变的模型。

三、治疗性克隆面临的问题

(一)亟待解决的问题

1 .体细胞克隆效率与 ntES细胞建系效率普遍较低

核移植胚发育至囊胚的几率为 19%25%,与牛、猪的核移植囊胚发育率相当分别约为 25%和约为 26%;从克隆囊胚获得 ntES细胞的效率仅有 4%-16%,平均 8.2%[11]

由于目前核移植技术和干细胞技术自身的许多问题还没有根本解决,从现有的文献报道来看, ntES细胞建系的效率还很低。克隆囊胚获得 ntES细胞的效率仅有 416%,平均 8.2%,要得到一个 ntES细胞系平均需要 12个囊胚,而需要的卵母细胞数就更多了,一个 ntES细胞系平均需要 666个。如果 ntES细胞系用于人类疾病的治疗,这样的代价是非常大的,即使目前报道的最高效率的建系,也是 30个卵母细胞,才能得到一个 ntES细胞系。

另外,在人-动物 ntES细胞的研究中,供体核的年龄对 ntES细胞的形成效率影响不明显,但是对囊胚形成早期有影响。 Chen [7]研究发现, 5岁年龄组 24细胞期融合胚形成率 21.7%明显低于 425260岁组 39.4%,37.0%,53.4%60岁组 24细胞期融合胚形成率最高。这些结果提示,供体核的年龄对囊胚形成早期有影响,但是在囊胚期,各年龄组之间并无显著差异。这些数据显示年龄对体细胞核的重编程潜力没有影响。

2 .卵母细胞来源问题

ntES 细胞用于人治疗性克隆,卵母细胞的需求量是非常大的,目前尽管已有许多措施来改进核移植技术,但是仍没有明显提高。要得到一个 ntES细胞系平均需要 12 个囊胚,而需要的卵母细胞数就更多了,一个 ntES细胞系平均需要 666 个。如果 ntES细胞系用于人类疾病的治疗,这样的代价是非常大的,即使目前报道的最高效率的建系,也是 30 个卵母细胞,才能得到一个 ntES细胞系。 另外一种替代策略就是利用非灵长类异种哺乳动物的卵母细胞,例如兔、山羊等。我们也应用兔卵目细胞作为受核体,将人成纤维细胞核移植其内,建立了人 -兔核移植囊胚,正在分离 ntES细胞,以解决人卵母细胞来源困难问题。

从上面分析结果看, ntES细胞用于人克隆性治疗,卵母细胞的需求量是非常大的,目前尽管已有许多措施来改进核移植技术,但是仍没有明显提高。解决这一问题的关键是用新的策略获得卵母细胞。第一种方法是诱导分化现有的 ES细胞系,得到卵母细胞,理论上可以收集到数量无限的卵母细胞,大大减少对人卵母细胞的需要量。 Oct4 蛋白是一种 DNA结合蛋白,在胚胎发育早期, Oct4基因的表达能促进胚胎生殖( EG)细胞的形成,在 EG细胞的生成中起重要作用,被认为是生殖细胞特异性基因 [ 12, 13] 2003 年, Hubner [ 14] gcOct4-GFP 报告基因转入鼠 ES细胞中,分离出 Oct4+c-kit+克隆,发现在体外能向卵泡样结构分化,通过检查卵母细胞特异性标志( ZP1 , ZP2,ZP3等)和减数分裂标志物( DMCISCP3),证实能分化成卵母细胞。从 ES细胞诱导分化出生殖细胞为取得卵母细胞提供了一种新途径。

ntES 细胞的产生过程中,去核卵母细胞只是为供核重编程发育至囊胚提供了一个“温室”,除了线粒体 DNA,去核卵母细胞并不携带自身的遗传物质。因此,另外一种策略就是利用非灵长类异种哺乳动物的卵母细胞,例如兔。然而,人-动物 ntES 细胞,还存在着伦理上的争议。从长远的方面看,应该发展非卵母细胞依赖的 ntES培育方法,例如,利用体细胞和去核的 ES细胞进行融合,或者提取 ES细胞和卵母细胞来源的重编程因子,注入体细胞内,使其“返祖”至胚胎期,获得 ntES细胞。

最近( 2005-8-24), 中国科学院动物研究所陈大元教授透露,国际首例体细胞克隆亚洲黄牛日前在山东顺利降生。这是世界上第一次“用”山羊克隆出亚洲黄牛。据介绍,亚洲黄牛的克隆成功不仅证明成年黄牛的成纤维体细胞能在异种品系的普通山羊的去核卵母细胞胞质中去分化,恢复全能性。从而表明普通山羊的卵母胞质可以“指令”亚洲黄牛的体细胞核发育,并能“指导”异品种重构胚胎在普通山羊、黑山羊、奶山羊受体子宫中着床、妊娠、分娩全程发育。这个研究的还为应用动物克隆人体器官提供了一个新的研究思路。

(二)       安全性和伦理学问题:

异种重构胚在发育早期含有两种线粒体,以后供核体的线粒体取代了受体的线粒体。利用人—动物重构胚制备治疗性克隆,有可能由于带进去供核体的线粒体而缓解动物线粒体与人细胞核之间的不相容性。但是人和动物的重构胚还存在安全性问题,尚待解决。受体卵浆中所带的异种蛋白,包括细胞器及 mRNA,它们的命运如何,是否也像线粒体一样完全被供核体所取代,还有待进一步证明。

利用动物去核卵母细胞与人体细胞融合而产生胚胎来提取干细胞的伦理问题,也是争论的一个焦点。人畜细胞不可避免的结合和相互作用侵犯了生命的尊严。世界发达国家政府对克隆技术都采取了比较谨慎的态度。 世界绝大多数国家如 国、德国、日本、澳大利亚、墨西哥、美国、新西兰、英国、巴西、意大利以及欧盟等都坚决反对克隆人。除日本等少数国家对人类胚胎也禁止外,绝大多数国家对 为医学目的 克隆人类胚胎表示支持。 2000821日,美国政府批准允许科学家使用人类胚胎进行治疗性克隆研究,但同时指出,以培育婴儿为目的的再生性克隆——人类胚胎克隆仍属违法。同年 824日美国国立卫生研究院 (NIH)解除了对人多能干细胞研究的禁令。

胚胎生物技术涉及使用早期未着床的胚胎,特别是治疗性克隆技术还将无法避免的使用通过体细胞克隆获得的人的早期克隆胚胎。世界各国尤其是西方国家对此争论很大 [12,13] 。迫于社会公众与宗教的压力,大多数西方国家对治疗性克隆技术应用于人类,持反对态度,不允许国家科研经费支持治疗性克隆的研究。 临床应用问题:如 ES细胞系可能在培养过程中出现染色体非整倍性问题, ES细胞定向分化能力及分化细胞的稳定性问题; 其次,异种核移植产生的人-动物重构胚还存在安全性问题:异种重构胚在发育早期含有 2种线粒体,以后供核体的线粒体取代了受体的线粒体,但受体卵浆中所带的异种蛋白,包括细胞器及 mRNA,它们的命运如何,是否也像线粒体一样完全被供核体所取代,还有待进一步证明。再次,在核移植的过程中,可能存在跨种间病毒传染,比如,人 -兔核移植胚胎干细胞,有可能将 某些目前未知的兔疾病传染给人类,就像艾滋病病毒可能是从非洲猩猩而来

建立人 -人核移植胚胎干细胞系,还有许多技术和伦理法律问题需要研究解决,如提高治疗性克隆的成功率、人卵母细胞的来源、细胞分化诱导条件的优化、体外细胞的扩大培养以及法律和伦理等。本研究组在国家自然科学基金“用人核移植胚胎干细胞建立个体化肝细胞的研究”的资助下,与西北农林科技大学合作,已经在人 -山羊核移植胚胎构建方面取得了一定进展,为下一步研究奠定了基础。由于我国在治疗性克隆研究领域有其技术优势和宽松的人文环境,并有法律保证, 2004 年元月,中国科技部 、卫生部 正式 出台我国《人胚胎干细胞研究伦理指导原则》,允许开展胚胎干细胞和治疗性克隆研究,禁止生殖性克隆人研究,这些法律为科学家们从事治疗性克隆的研究提供了保证。

2005 910日,据英国媒体报道,英国人类生育和胚胎技术管理局( HFEA)发放许可令,同意纽卡斯尔大学研究人员进行一项颇为争议的胚胎实验:将一个男子的精子与女人卵子受精形成的胚胎中的原核( pronuclei)取出,植入另一个健康女人的未受精卵子中,形成一枚新的胚胎。从理论上说,当这枚胚胎植入子宫怀孕诞生后,他将在生物学意义上拥有一个爸爸、两个妈妈。这项研究有着广阔的医学前景,然而也引来了一些反对组织的强烈批评,他们指责英国科学家的实验既危险又违反了伦理。

(三)      建立我国知识产权的治疗性克隆技术

随着干细胞技术和体细胞核移植技术的研究进展,我国学者在治疗性克隆的技术方面也处于世界前列。当前,在我国研究和发展治疗性克隆技术,建立我国知识产权的治疗性克隆的细胞产品,创建细胞治疗产业,是一个很好的机遇。我国在治疗性克隆研究领域的优势: 目前,我国在哺乳动物克隆技术的研究方面处于国际先进水平,相继成功克隆出了牛、羊等动物。 1991年,西北农林科技大学生物工程研究所在世界上首次获得山羊胚胎细胞核移植成功,共得到 5只羊羔。 1998年,该研究小组用来自成年雌性山羊的皮肤成纤维细胞作供体,采用细胞质内直接注射的方法将供体细胞核直接注入去核卵母细胞内,胚胎激活后移植到受体母羊子宫角,获得了 2只体细胞核移植后代,这是世界上首批成年体细胞克隆山羊,并获得了克隆山羊的第 4代后裔,目前生长健康。 宽松的人文环境。 中国公众有着不同于西方的伦理观念,对于动物权利和早期胚胎的担心没有西方国家严重,也基本没有因为宗教信仰而反对胚胎生物技术的问题。 法律和法规的基本保证。为保证和促进人胚胎干细胞研究的健康发展,国家科技部和卫生部联合下发了《人胚胎干细胞研究的伦理指导原则》,使治疗性克隆的研究合法化。但我国明令禁止克隆人和买卖人类胚胎。

然而,为何中国的上述优势不能在治疗性克隆的研究领域走在国际前列?主要原因是经费不足和相关学者们的研究大多各自为战,不能很好的合作研究。当前,应用克隆技术结合胚胎干细胞体外诱导分化和细胞治疗方法,是学者们亟待解决的关键技术问题。因此,我们强烈呼吁,临床学者与基础细胞生物学家联手合作,可借鉴韩国学者的思路,应用自愿者的卵母细胞,建立中国人的 ntES培养技术,为治疗性克隆的临床应用奠定基础。我们相信,中国有可能在这个领域走在世界前沿。

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