细胞外乙型肝炎病毒
DNA是一种松弛环状的双链
DNA(
relaxed circular DNA,
rcDNA)分子,其两条链均不是闭合的,其中负链较长,约
3200个碱基,含有乙肝病毒基因组的全长基因,在其
5’起始端与
3’末端之间有一数个碱基的“缺刻”
(nick);正链较短,有较大的“缺口”
(gap),其
3’末端不固定,故长度是可变的,约为负链长度的
50%~
100%。在乙肝病毒的复制过程中,病毒
DNA进入宿主细胞核,在
DNA聚合酶的作用下,两条链的缺口均被补齐,形成超螺旋的共价、闭合、环状
DNA分子(
covalently closed circular DNA,
cccDNA)。
cccDNA是乙肝病毒前基因组
RNA复制的原始模板,虽然其含量较少,每个肝细胞内只有约
5~50个拷贝,但对乙肝病毒的复制以及感染状态的建立具有十分重要的意义,清除细胞核内的
cccDNA,才能彻底清除乙肝患者病毒携带状态,是抗乙肝病毒药物治疗的目标。
1.
乙肝病毒
cccDNA的检测方法
cccDNA
和
rcDNA在结构和理化特性上有三点不同:①
rcDNA在正链与负链上均有缺口或缺刻,只是部分区域互补故能形成环状结构,但非超螺旋结构;而
cccDNA两条链均是完整的,二者共价互补,形成超螺旋结构。②
rcDNA能与蛋白质共价结合,
cccDNA则不能。③由于缺口或缺刻的存在,
rcDNA可以被一些核酸酶如外切核酸酶Ⅲ
(exonuclease Ⅲ
)、绿豆核酸酶
(mung bean nuclease)等降解成寡核苷酸或单核苷酸,而
cccDNA则由于是超螺旋且双链结构均是完整的,一般不会被上述酶降解。上述差异是设计和建立
cccDNA检测技术的基础。本文就有关
cccDNA 常用检测方法作简要介绍。
1.1
细胞内
cccDNA的抽提与纯化
最常用的抽提细胞内
cccDNA的方法是蛋白质-去污剂沉淀法,其原理是基于
rcDNA和
cccDNA与蛋白质结合能力的差异。具体方法是:用不含蛋白酶的细胞裂解缓冲液裂解细胞
1~
2小时,然后加
KCl溶液(终浓度为
0.5M)剧烈震荡,高速离心。
rcDNA能与蛋白质共价结合,与绝大多数细胞染色体
DNA一起形成沉淀,而
cccDNA不能与蛋白质结合故游离于上清中,用酚氯仿抽提上清即可得到
cccDNA。如果想进一步得到
rcDNA,则可将沉淀重新用蛋白酶消化,然后用酚氯仿抽提[
1,2]。该方法较为经典和实用,已被大多数文献所引用。根据笔者的经验,该方法的主要缺点是:抽提较为费时,一般需要
4~
5小时;酚氯仿抽提环节多、得率不高;对于冻存的富集细胞(
pellet)难以充分裂解,单裂解这一步可能需要
3~
4小时甚至更长时间。此外,在上清中实际仍然含有少量的
rcDNA,而在沉淀中实际
上也存在着一部分
cccDNA。
为进一步将
cccDNA与
rcDNA、单链
DNA分开,可以对抽提产物进行纯化。以酶切法最为最常用。外切核酸酶Ⅲ是一种
3’→
5’外切酶,对带有钝端、
5’突出端或有缺口的双链具有特异性,而不能降解带有
3’突出端(至少
4个碱基)的双链
DNA。绿豆核酸酶则以内切方式降解单链
DNA或
RNA,而保持双链
DNA的完整性(二者的比活性
>1000),可用于选择性切除双链
DNA的突出单链末端,以及切除单链
DNA或
RNA。也可单用绿豆核酸酶酶切
rcDNA[
3],或先用外切核酸酶Ⅲ将
rcDNA降解成单链,然后再用绿豆核酸酶酶切[
4]。使用该方法时,把握酶的用量和酶切时间较为关键,否则
cccDNA也可能被损伤。该方法也有其缺点:如抽提产物被稀释,降低了检测的敏感;绿豆核酸酶的反应缓冲液对
PCR反应有抑制作用等。
我们尝试用小量质粒抽提试剂盒抽提去抽提
HepG
2.2.15细胞内的
cccDNA,结果发现得率比上述所用方法均要高,操作也简便,所有操作在
30分钟内就可完成。
1.2 cccDNA
的定性检测
既往绝大多数文献报道的是用
Southern blot对
cccDNA进行定性检测,该方法是分子生物学的经典方法,但检测要求较高,多只能在专业分子生物学实验室进行,难以在临床常规开展。
近年来,也有较多文献报道用
PCR技术对
cccDNA进行检测。但是,正由于
PCR技术灵敏度极高,
rcDNA和
cccDNA的序列又具有高度的同源性,因此在用
PCR技术检测
cccDNA时,要确保只能扩增
cccDNA而
rcDNA不被扩增。目前利用
rcDNA和
cccDNA结构上的差异可以解决这一问题。由于
rcDNA的正链和负链上均存在缺口,故可以设计跨越两个缺口的引物,使
rcDNA不会被扩增,而
cccDNA由于是完整的双链结构则可以被选择性扩增。同时可设计另一对不跨越缺口的引物或只跨越一条链的缺口的引物同时检测
cccDNA和
rcDNA。
Kock等[
5]成功地用这种选择性
PCR的方法在检测感染细胞内的
cccDNA和
rcDNA。
此外,为进一步提高检测的灵敏度,可用套式
PCR(nested PCR)的方法。
但是有报道认为跨缺口引物对两种
DNA的选择性不是绝对的,在
PCR检测
cccDNA时,起始模板量不能过高,否则
rcDNA也有可能被扩增,
Kock等发现每个
PCR反应管中
HBV DNA的量在
1 pg(约
6×
105拷贝)时能达到最佳的灵敏度与选择性,因此在分析前应估计标本中
HBV DNA的量[
5]。虽然套式
PCR更为灵敏,但由于需取
PCR产物进行再次扩增,因此在操作中要注意防止
PCR产物污染,避免假阳性。
1.3 cccDNA
的定量检测
在定性检测的基础上,可以进一步对
cccDNA进行定量检测。仍以
PCR定量分析技术中竞争
PCR的精确度高,方法是在
PCR反应管中加入一种已知量的、能与野生模板(即需要检测的目的基因)
等效扩增的内参照,内参照是经过突变处理的,其两端尤其是引物退火区的序列与野生模板相同。
PCR扩增后通过一定的方法将野生片段与突变片段区分开,分别计算其绝对量,或求出其相对比值,就可以推算
PCR扩增以前野生模板的量[
6]。
He
等[
7]建立了实时荧光定量
PCR检测
cccDNA的方法。他们将
Taqman MGB探针设计在负链缺刻的下游,与负链互补结合。对
cccDNA,在上游引物的引导下,
Taq酶到达
Taqman MGB探针所结合的位点,利用其
5’→
3’外切活性将探针切断,
3’端的淬灭基团失去对
5’端的发光基团的抑制作用,从而产生荧光信号。每扩增一个
cccDNA分子,就会产生一个荧光信号,
PCR仪可对产生的信号进行实时监测,根据荧光信号的强弱对
cccDNA进行定量。对
rcDNA,由于上游引物引发的链延伸不能通过负链缺刻,故不能使
Taqman MGB探针被
Taq酶切断产生荧光信号。该方法的特异性比选择性
PCR进一步提高,可以消除高
rcDNA背景可能产生的非特异性扩增,该方法的检测低限可达每个反应
100个拷贝,所有检测在
2小时内可完成。
Shao
等
8]采用嵌合引物和实时定量
PCR法对
cccDNA进行实时荧光定量。该方法的设计与
He等的方法有异曲同工之处,即都是利用
rcDNA与
cccDNA分子结构上是否完整来有效地将二者区分开来,实现对
cccDNA的特异性检测。该方法在荧光探针位置的选择上更符合荧光
PCR的要求,即探针越靠近引物效果越好,这样检测到的荧光信号质量和实时扩增曲线形状可能更佳,而在
He等的方法中探针与上游引物点之间的距离则至少需要在
230个碱基以上。但是,该方法存在与套式
PCR类似的缺点,即需要分两步操作,中间需要打开反应管进行二次加样。
2.
乙肝病毒
cccDNA检测的临床意义
2.1
评价抗乙肝病毒药物的新指标
目前临床上评价干扰素、核苷类似物这些抗乙肝病毒药物时存在一个很大的问题,即其评价指标主要是肝功能的改善与否、血清乙肝病毒
DNA水平的变化以及肝组织的病理学改变等。诚然,这些指标对临床医生判断患者病情而言非常重要和实用,也是临床医生选用抗乙肝病毒药物时的依据,然而对于何时停用抗病毒药物、停用抗病毒药物后乙肝病毒是否会重新复制活跃导致乙肝复发则缺乏客观而有效的指标。我们认为,开展肝细胞内乙肝病毒
cccDNA的动态的定量监测可以部分解决这个问题。治疗前后肝细胞内乙肝病毒
cccDNA的含量的变化应该纳入到抗乙肝病毒药物评价的指标体系中来,从一定意义上说,只有能够彻底清除乙肝病毒
cccDNA的药物,才能算是真正“有效”的抗病毒药物。
Schultz
等[
9]用鸭干扰素-γ
(DuIFN-γ
)分别在
DHBV感染前后作用于原代培养鸭肝细胞,发现
100 U/ml的
DuIFN-γ可使细胞内
cccDNA水平下降至
1/10~
1/20。在
DHBV感染前
1天加
DuIFN-γ,感染后
4天细胞内仍然可以检测到
cccDNA,但仅相当于不加药对照组感染后
1天的水平,说明在
DuIFN-γ作用下,新感染病毒的
rcDNA仍然可以转化为
cccDNA,但子代
rcDNA通过细胞内通路扩增形成
cccDNA的过程受到抑制。
Mason等[
10]以拉米夫定治疗
WHV感染的土拨鼠,结果发现可使血清病毒的滴度下降至初始水平的
0.3%甚至更多,但在维持治疗
3~
12个月后,
95%的土拨鼠肝脏细胞中仍然能检测到病毒,
cccDNA水平无明显改变,但有
3只土拨鼠感染肝细胞的比率和肝细胞内
cccDNA的水平有显著下降(给药组
2只,对照组
1只),作者认为这可能是免疫清除的结果而非药物的作用。
Addison等[
11]用拉米夫定和一种双脱氧鸟苷前体物质—
2-氨基
-6-甲氧嘌呤
-2’
,
3’-双脱氧核糖甙
(2-amino-6-methoxypurine
-2’,
3’-dideoxyriboside)联合作用于先天感染的北京鸭
5个月,然后取肝脏活检标本检测
cccDNA,结果发现
5只鸭中有
3只
cccDNA水平呈指数下降,其半寿期长达
35~
57天,另
2只
70天内呈指数下降,但此后均稳定在
6拷贝
/细胞的水平。检测鸭肝细胞内细胞分裂标志物—增殖细胞核抗原(
proliferating cell nuclear antigen, PCNA)发现,前者细胞内
PCNA染色阳性细胞核的数量显著多于后者。提示可能是肝细胞的转化导致了细胞内
cccDNA的减少,而不是拉米夫定的作用。
Dandri等[
12]以不同剂量
(1μmol/L、
10μmol/L、
100μmol/L)的阿德福韦
(adefovir)作用于原代培养的
WHV感染土拨鼠肝细胞,发现均可使
WHVDNA合成下降
90%,病毒颗粒的分泌量下降
98%,但对
cccDNA的合成没有影响,对包膜蛋白的分泌和
RNA的合成无作用。即使在培养基中加入表皮生长因子作用
14天以诱导细胞转化(
turnover)发生分裂,但细胞内
cccDNA水平仍无变化,提示
cccDNA可被从母代细胞转运到分裂形成的子代肝细胞中。
L-Fd
4C (2',3'-dideoxy-2',3'-didehydro-beta-L-5-fluorocytidine)是近年来发现和研究较多的核苷类抗病毒药物,其体外抗病毒活性至少较拉米夫定强
10倍[
17]。
Zoulim等[
13]用
Fd
4C作用于原代培养的鸭肝细胞,发现它对逆转录酶的抑制作用强于拉米夫定等其它胞苷类似物,具有持久的抑制病毒复制的作用,但对
cccDNA的水平没有影响。当用
Fd
4C处理病毒感染的鸭和土拨鼠时,对病毒血症和
DNA的合成也强于拉米夫定,但是停药后很快复发,因为
cccDNA在肝细胞内持续存在。
除干扰素和核苷类似物外,也有人研究了其他药物对
cccDNA的影响。
Turin等[
14]用细胞周期阻断剂丁酸钠作用于体外培养的鸭肝细胞。丁酸钠是一种细胞分裂抑制剂,能可逆地将细胞周期阻断于
G0/G1期。他们发现虽然它不能阻止起始的病毒基因组转变为
cccDNA,但可以抑制随后的
cccDNA扩增。但这种作用是可逆的,一旦撤除丁酸钠,
cccDNA水平又将上升。
Thermet等[
15]用包含
DHBV大包膜蛋白基因的质粒作为治疗性
DNA疫苗治疗慢性携带
DHBV的鸭,发现可以显著减少病毒的复制,更有意义的是,在一些鸭(
7/30)的肝细胞内,
cccDNA已被完全清除。治疗性
DNA疫苗也许是一种清除
HBV感染肝细胞内的
cccDNA、减少复发的有前景的方法。其它旨在阻断病毒在细胞内复制、转录、翻译乃至释放的某一个环节的抗病毒药物则很难清除
cccDNA,因为
cccDNA池已经在感染肝细胞内形成,而肝细胞是相当稳定的几乎不分裂的细胞,即使肝细胞发生分裂,
cccDNA还可以被分配到子代细胞中去,并通过负反馈调节机制最终保持稳定。
2.2
评价抗乙肝病毒是否能感染肝外组织的客观指标之一
乙肝病毒不仅仅是一种嗜肝病毒,一些肝外组织中也可检测到乙肝病毒
DNA,如肾脏、胰腺以及外周血单个核细胞(
peripheral blood mononuclear cell,
PBMC)等。早就有人发现乙肝病毒可以感染白细胞[
16,
17]
,而这种免疫细胞的感染似乎有利于病毒逃避免疫反应,从而导致机体清除乙肝病毒的能力下降。关于
PBMC能否被乙肝病毒感染的问题目前仍有争议,其中一个重要的原因是没有确立
PBMC被感染的标准。我们认为把
PBMC细胞内是否存在
cccDNA作为判断感染的标准是最可靠的。
cccDNA的形成是乙肝病毒的侵入细胞后在细胞内进行复制的起始步骤,也是转录合成前基因组
RNA(pregenomic RNA,pgRNA)的前体,是建立病毒感染状态的最重要标志,没有
cccDNA的形成也就没有其后的一系列过程。
Kock等[
5]用乙肝病毒去感染体外培养的外周血单个核细胞(
peripheral blood mononuclear cell,
PBMC)时,发现不能在细胞内检测到
cccDNA,相反,如果转染的是肝细胞,则非常容易检测
cccDNA。此外,在乙肝患者的肝组织内,能检测到
cccDNA和
rcDNA,而在其
PBMC中,则只能检测到
rcDNA。因此作者认为乙肝病毒是不能感染
PBMC的,即使
PBMC中检测到乙肝病毒,也只是肝脏中的病毒释放到血液中后可能与
PBMC表面牢固结合,不易被
PBS等洗涤下来,抽提细胞所得到的病毒
DNA其实并不存在于细胞内;或病毒仅仅是被
PBMC所“吸收”
(absorption),并没有建立真正意义上的感染状态。这一实验结果给我们很多启发,也加深了对乙肝病毒感染的认识。
2.3
评价乙肝患者病情
我们用选择性荧光定量
PCR对
93例乙肝患者血清作回顾性分析时,发现
24例患者血清用选择性引物扩增呈阳性,其中急性乙肝
1例,慢性乙肝(轻度)
6例,慢性乙肝(中度)
6例,慢性乙肝(重度)
3例,肝炎肝硬化
2例,慢性乙肝(重型)
6例,也就是说慢性乙肝(中度)以上的病例占
70%以上。虽然经过统计学分析还不能看出显著差异,样本量还不足够大,血清
cccDNA阳性与病情的轻重是否存在某种关系还有待于进一步的深入研究。但是,从理论上推测,既然存在于肝细胞胞质和线粒体中的转氨酶等酶类在肝细胞被破坏时能释放到血液中,那么存在于肝细胞核内的
cccDNA分子在肝细胞变性、坏死时应该也可以释放到血液中,而且病情越严重,变性坏死的细胞越多,对于同一个患者而言其血液中的
cccDNA水平应该也相应地越高。目前通过肝活检来监测乙肝患者肝组织中的
cccDNA水平变化存在着一定困难,因而监测血液中的
cccDNA的动态变化也许更具有现实意义。当然,其中还存在一些问题有待研究和解决,比如血液中的
cccDNA水平远远低于肝组织中的
cccDNA水平,也远远低于血液中的的
rcDNA水平,因此在
cccDNA定量检测的灵敏度必须进一步提高。
3.
展望
目前我们对
cccDNA的认识有待提高。在检测技术上还有许多问题需要解决,比如,如何提高灵敏度,如何避免
rcDNA同时被扩增(国内有些文献报告的结果可能忽略了这一点),如何简化操作步骤以便广泛应用等。检测或监测
cccDNA的临床意义也有待挖掘,比如可以通过细胞或动物模型来评判新药的抗病毒作用;
HBV感染基础上发生的肝衰竭,其病情和预后能否通过
cccDNA水平获取一定的信息;肝外组织感染的问题也可以通过检测组织细胞中是否存在
cccDNA得到解释;基因或免疫治疗的靶向可以定位于
cccDNA;
cccDNA对肝细胞染色体是否起作用值得探索,这对阐述肝细胞的癌变机制可能有益。
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